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qPCR 每次結果都不太一樣?!究竟為哪般?

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/4/12     瀏覽次數:    

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同樣是做熒光定量 PCR 實驗,用了文獻里的方法,照搬了人家的引物,為什么結果總是不太一樣?

同樣是做熒光定量 PCR 實驗,用了文獻里的方法,照搬了人家的引物,為什么結果總是不太一樣?


我們往往謹慎對待:引物、探針、Ct 值等,但也有一些小東西會被忽視,比如:ROX?。也許很多同學的第一反應是:總聽人說起 ROX?,但它是什么?它在熒


光定量 PCR 里起到什么作用呢?


其實和 FAM?、VIC?、SYBR? Green 類似,ROX? 也是一種在 qPCR 反應中能被 qPCR 儀檢測到的熒光染料分子。但與其他染料不同,ROX? 是一種惰性參比染料,也就是說,其熒光信號并不隨著 PCR 擴增而增強。相反,ROX? 的熒光信號值在反應中是基本保持不變的。


ROX? 有什么用呢?


其實,在 qPCR 反應中有許多反應本身的物理因素會影響信號檢測,從而造成孔間數據的差異。例如:PCR 反應板本底信號不均一,PCR 管蓋厚度有差異,同一反應體系在分裝時出現了差異等因素。ROX? 能幫助我們通過均一化校正消除這些因素的誤差,從而提高數據精確性。


ROX? 的工作原理:

請大家注意看板上的兩個孔,我們在每個孔中加入「完全等量」的樣本,然后進行擴增。很快,30 個循環完成了。在每一個循環中,我們的儀器都會讀取出一個熒光信號值。




理論上儀器檢測出這兩個孔的信號值應該是完全相同的,因為剛開始的時候樣品是完全一樣的。但實際上,由于移液器加樣存在誤差,耗材孔間不同等一系列差異,這兩孔檢測出的信號值并不相同。幸運的是,我們在兩個孔中都加了相同的 ROX?,而我們的儀器也同時讀取了 ROX? 的信號值。


可以看到,ROX? 信號和 qPCR 反應熒光信號都有差異。仔細思考大家會發現,反應本身的這些物理差異會對 ROX? 信號和 qPCR 反應的熒光信號造成同等程度的影響。




重要的是,我們的儀器會在每一個循環中檢測每一個反應孔的這兩種信號,然后在反應結束后自動進行均一化處理。結合儀器自身的一系列熒光校準參數,最終您的數據精度會得到顯著提高。順便提一下,最終這個值也就是我們所說的 Rn 值,也表示報告基團的標準化熒光值。




兩個關于 ROX? 的重點:

第一,除非有些特殊情況,Applied Biosystems? 提供給您的熒光定量預混液已經包含了最佳濃度的 ROX?,因此您無需再額外添加。


第二,所有 Applied Biosystems? 實時熒光定量 PCR 軟件是默認檢測 ROX? 并使用均一化數據,這會幫您提高數據精確性。如果您選用的試劑盒或者預混液不含 ROX?,依據您對實驗的精度的要求不同,您可以另外采購 ROX? 摸索最佳濃度優化實驗,您也可以將參比熒光染料選項改為 None(無),放棄 ROX 校正。在沒有 ROX? 存在的情況下,我們建議選擇參比熒光為 None 進行數據分析。

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